Иммуногистохимическая верификация синапсов и применение машинного обучения для анализа синаптоархитектоники СА3 гиппокампа белых крыс в постишемическом периоде

Рассмотрены методические аспекты применения алгоритмов машинного обучения для поиска новых возможностей в интерпретации межнейронных связей. Цель исследования – показать, что комбинация Ilastik и StarDist эффективна для морфометрической характеристики гигантских синаптических терминалей в stratum lucidum СА3 гиппокампа белых крыс в норме и в постишемическом периоде. Материал и методы. Ишемию головного мозга у белых крыс Wistar моделировали двусторонней окклюзией общих сонных артерий (ООСА) на 20 мин. Исследовались животные без воздействия (n=6, контроль) и через 6 ч, 1, 3, 7, 14 и 30 сут после ООСА (n=36). Использовали окраски гематоксилином и эозином, тионином по Нисслю, иммуногистохимическую реакцию на синаптофизин. Определяли численную плотность (ЧПТ), размеры, интенсивность окраски и площадь терминалей, применяли плагины Ilastik и StarDist на платформе ImageJ/Fiji. Статистический анализ проводили непараметрическими методами в программе Statistica 8.0. Результаты. Относительная площадь терминалей при ручном методе и машинном обучении не различалась. Машинное обучение предоставило дополнительную информацию о численной плотности, размерах и средней яркости терминалей. Через 6 ч после ООСА ЧПТ уменьшилась на 44,3%, но затем восстанавливалась в течение 7 сут. Средняя площадь терминалей была больше на 16,7% через 6 ч и 1 сут, а через 14 сут – меньше контрольного уровня. Яркость пикселей терминалей была обратно пропорциональна содержанию в них хромогена: увеличивалась через 6 ч и 1 сут после ООСА, затем восстанавливалась до уровня контроля. Корреляционные связи наблюдались между площадью и яркостью терминалей (R=0,78). Заключение. Использование комбинации Ilastik и StarDist позволило точно оценить численную плотности, размеры, форму, относительную площадь и интенсивность окраски синаптических терминалей в гиппокампе. В сравнении с ручным методом, применение машинного обучения обеспечило значительно больше информации о терминалях на цветных иммуногистохимических изображениях.

1. Авдеев Д.Б., Акулинин В.А., Степанов А.С., Горбунова А.В., Степанов С.С. Плейотропные ферменты апоптоза и синаптическая пластичность гиппокампа белых крыс после окклюзии общих сонных артерий. Сибирский медицинский журнал. 2018;33(3):102–110. doi: 10.29001/2073-8552-2018-33-3-102-110.

2. Боровиков В. Statistica. Искусство анализа данных на компьютере. 2-ое изд. СПб: Питер; 2003. 688.

3. Семченко В.В., Степанов С.С, Ерениев С.И. Синаптическая пластичность головного мозга (фундаментальные и прикладные аспекты). М: Директ-Медиа; 2024. 416.

4. Степанов С.С., Кошман И.П., Шоронова А.Ю., Калиничев А.Г., Акулинин В.А., Степанов А.С., Авдеев Д.Б., Маркелова М.В. Структурные основы изменения межнейронной коммуникации нейронов поля СА3 гиппокампа белых крыс после тяжелой черепно-мозговой травмы. Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2021;65(1):22–34. doi: 10.25557/0031-2991.2021.01.22-34.

5. Степанов А.С., Акулинин В.А., Степанов С.С., Авдеев Д.Б., Горбунова А.В. Коммуникация нейронов поля CA3 гиппокампа головного мозга белых крыс после острой ишемии. Общая реаниматология. 2018;12(5):38–49. doi: 10.15360/1813-9779-2018-5-38-49.

6. Степанов С.С., Макарьева Л.М., Акулинин В.А., Коржук М.С., Шоронова А.Ю., Авдеев Д.Б., Цускман И.Г., Слободская А.В. Сопоставление иммуногистохимического и ультраструктурного изучения реакции аксональных терминалей сенсомоторной коры белых крыс на перевязку общих сонных артерий. Журнал анатомии и гистопатологии. 2022;11(3): 65–74. doi: 10.18499/2225-7357-2022-11-3-65-74.

7. Berg S, Kutra D, Kroeger T, Straehle Ch. et al. Ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 2019;16(12):1226–1232. doi: 10.1038/s41592-019-0582-9.

8. Calhoun ME, Jucker M, Martin LJ, Thinakaran G, Price DL, Mouton PR. Comparative evaluation of synaptophysin-based methods for quantification of synapses. J Neurocytol. 1996;25(1):821–828. doi: 10.1007/BF02284844.

9. Ciresan Dan, Meier U, Schmidhuber J. Multicolumn deep neural networks for image classification. 2012 IEEE Conference on Computer Vision and Pattern Recognition: journal. 2012:3642–3649. doi: 10.1109/cvpr.2012.6248110.

10. Cortada M, Sauteur L, Lanz M, Levano S, Bodmer D. A deep learning approach to quantify auditory hair cells. Hear Res. 2021;15(409):108317. doi: 10.1016/j.heares.2021.108317.

11. Dailey ME, Buchanan J, Bergles DE, Smith SJ. Mossy fiber growth and synaptogenesis in rat hippocampal slices in vitro. J Neurosci. 1994;14(3Pt1):1060–1078. doi: 10.1523/JNEUROSCI.14-03-01060.

12. Fazeli E, Roy NH, Follain G, Laine RF, von Chamier L, Hänninen PE, Eriksson JE, Tinevez JY, Jacquemet G. Automated cell tracking using StarDist and TrackMate. F1000Res. 2020;28(9):1279. doi: 10.12688/f1000research.27019.1.

13. Grys BT, Lo DS, Sahin N, Kraus OZ, Morris Q, Boone C, Andrews BJ. Machine learning and computer vision approaches for phenotypic profiling. J Cell Biol. 2017;2(216(1)):65–71. doi: 10.1083/jcb.201610026.

14. Herbert AD, Carr AM, Hoffmann E. FindFoci: A Focus Detection Algorithm with Automated Parameter Training That Closely Matches Human Assignments, Reduces Human Inconsistencies and Increases Speed of Analysis. PLoS ONE. 2014;9(12):e114749. doi: 10.1371/journal.pone.0114749.

15. Ippolito DM, Eroglu C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. J Visual Experiments. 2010;16(45):2270. doi: 10.3791/2270.

16. Kreshuk A, Zhang C. Machine Learning: Advanced Image Segmentation Using ilastik. Methods Mol Biol. 2019;2040:449–463. doi: 10.1007/978-1-4939-9686-5_21.

17. Kreshuk A, Straehle CN, Sommer C, Koethe U. et al. Automated Detection and Segmentation of Synaptic Contacts in Nearly Isotropic Serial Electron Microscopy Images. PLOS ONE. 2011;6(10):e24899. doi: 10.1371/journal.pone.0024899.

18. Kurnia KA, Sampurna BP, Audira G, Juniardi S, Vasquez RD, Roldan MJM, Tsao CC, Hsiao CD. Performance Comparison of Five Methods for Tetrahymena Number Counting on the ImageJ Platform: Assessing the Built-in Tool and Machine-Learning-Based Extension. Int J Mol Sci. 2022;26(23(11)):6009. doi: 10.3390/ijms23116009.

19. Kurnia KA, Lin YT, Farhan A, Malhotra N, Luong CT, Hung CH, Roldan MJM, Tsao CC, Cheng TS, Hsiao CD. Deep Learning-Based Automatic Duckweed Counting Using StarDist and Its Application on Measuring Growth Inhibition Potential of Rare Earth Elements as Contaminants of Emerging Concerns. Toxics. 2023;8(11(8)):680. doi: 10.3390/toxics11080680.

20. Laux L, Cutiongco MFA, Gadegaard N, Jensen BS. Interactive machine learning for fast and robust cell profiling. PLoS One. 2020;11(15(9)):e0237972. DOI: 10.1371/journal.pone.0237972

21. Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. 5-th ed. Amsterdam, Boston: Elsevier Academic Press, 2005.

22. Pelkey KA, McBain CJ. Target-cell-dependent plasticity within the mossy fibre-CA3 circuit reveals compartmentalized regulation of presynaptic function at divergent release sites. J Physiol. 2008;586(6):1495–1502. doi: 10.1113/jphysiol.2007.148635.

23. Sommer C, Straehle C, Koethe U, Hamprecht FA. "Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit". 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. 2011:230–233. doi: 10.1109/ISBI.2011.5872394.

24. Tinevez JY, Perry N, Schindelin J, Hoopes GM, Reynolds GD, Laplantine E, Bednarek SY, Shorte SL, Eliceiri KW. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 2017 Feb 15;115:80-90. doi: 10.1016/j.ymeth.2016.09.016.

25. Urru A, González Ballester MA, Zhang C. 2D + Time Object Tracking Using Fiji and ilastik. Methods Mol Biol. 2019;2040:423–448. doi: 10.1007/978-1-4939-9686-5_20.

26. Weigert M, Schmidt U. Nuclei instance segmentation and classification in histopathology images with StarDist. In: Proceedings of the IEEE International Symposium on Biomedical Imaging Challenges (ISBIC), Kolkata, India, 2022. doi: 10.1109/ISBIC56247.2022.9854534.

27. Zhu J, Zou H, Rosset S, Hastie T. Multi-class AdaBoost. Statistics and Its Interface. 2009;2: 349–360. doi: 10.4310/Sll.2009.v2.n3.a8