Морфофункциональные особенности восстановления костной ткани при локальном использовании мезенхимальных стволовых клеток, таргетированных по Cdc42

Цель исследования – морфологическая оценка влияния ингибирования Cdc42 в мезенхимальных стволовых клетках (МСК) на процесс восстановления костного дефекта в отдаленном посттравматическом периоде у 24-месячных самцов крыс с переломом локтевой кости. Материал и методы. В эксперименте задействованы взрослые крысы Wistar (самцы массой 400–500 г, 24 мес; n=80), которым выполняли остеотомию диафиза локтевой кости. После травмы животных рандомизировали на четыре группы (по 10 крыс в группе). Животные группы I служили контролем и лечения не получали; животным группы II вводили старые МСК (клетки были выделены у крыс в возрасте 24 мес), группы III – старые МСК, модифицированные малой молекулой CASIN, группы IV – старые МСК, трансфицированные миРНК (нокдаун Cdc42). Выделяли два срока исследования через 4 и 6 мес после травмы. Количество вводимых клеток было одинаковым для всех экспериментальных групп – 1×106 клеток в 200 мкл натрийфосфатного буфера. Процедуру трансплантации клеток проводили однократно через сутки после перелома. Парафиновые срезы из зоны перелома окрашивали гематоксилином и эозинои, а также по методике Ван Гизона. Морфометрический анализ проводили с помощью программы ImageJ 1.53 плагина StarDist. Проверку статистических гипотез осуществляли с использованием непараметрических критериев в программе Statistica 8.0. Результаты. У всех животных в области перелома на месте мягкой костной мозоли формировались очаги с различной степенью созревания клеточного и межклеточного субстрата твердой костной мозоли. Сравнение процесса заживления дефекта локтевой кости у животных контрольной группы, не получавших дополнительных источников остеогенеза, и у животных трех групп, отличающихся степенью активности Cdc42, трансплантированных в зону повреждения МСК, показало наличие статистически значимых различий в количестве клеток основных регенерирующих пулов. Через 4 и 6 мес после травмы наиболее выраженное восстановление пула предшественников хондробластов и остеобластов, а также хондроцитов и остеоцитов, происходило при использовании МСК, трансфицированных миРНК. Это, вероятно, связано с максимальным подавлением активности Cdc42 в МСК и частичной блокадой старения этих клеток в зонах регенерации локтевой кости, что способствовало дальнейшей стимуляции остеогенеза. Заключение. Целенаправленное ингибирование и подавление активности Cdc42 перед трансплантацией МСК, выделенных из жировой ткани, значительно улучшают формирование незрелой костной мозоли и процесс ее трансформации в зрелую трубчатую кость у старых животных. Эти результаты подтверждают перспективность и целесообразность применения метода таргетирования Cdc42 в рамках комбинированной терапии переломов у пожилых.

1. Боровиков В. Statistica. Искусство анализа данных на компьютере. 2-ое изд. СПб.: Питер, 2003. 688.

2. Олжаев Ф.С., Акулинин В.А., Умбаев Б.А., Сафарова Ю.И., Степанов С.С., Гавриш Б.С., и др. Морфологическая характеристика зоны перелома локтевой кости крыс на фоне терапии модифицированными мезенхимальными стволовыми клетками при экспериментальном остеопорозе. Журнал анатомии и гистопатологии. 2024;13(3):49-59.

3. Arana M., Mazo M., Aranda P., Pelacho B., Prosper F. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells: isolation, expansion, and characterization. Methods Mol Biol. 2013;1036:47-61. DOI: 10.1007/978-1-62703-511-8_4.

4. Banavar SP, Trogdon M., Drawert B., Yi T.M., Petzold L.R., Campàs O. Coordinating cell polarization and morphogenesis through mechanical feedback. PLoS Comput Biol. 2021 Jan 28;17(1):e1007971. DOI: 10.1371/journal.pcbi.1007971.

5. Duan X., Perveen R., Dandamudi A., Adili R., Johnson J., Funk K., Berryman M,. Davis A.K., Holinstat M., Zheng Y., Akbar H. Pharmacologic targeting of Cdc42 GTPase by a small molecule Cdc42 activity-specific inhibitor prevents platelet activation and thrombosis. Sci Rep. 2021 Jun 23;11(1):13170. DOI: 10.1038/s41598-021-92654-6.

6. Falato L., Gestin M., Langel Ü. Cell-penetrating peptides delivering siRNAs: an overview. Methods Mol Biol. 2021;2282:329-352. doi: 10.1007/978-1-0716-1298-9_18

7. Festing MFW, Altman DG. Guidelines for the design and statistical analysis of experiments using laboratory animals. ILAR J. 2002;43(4):244-58. DOI: doi.org/10.1093/ilar.43.4.244.

8. Florian M.C., Leins H., Gobs M., Han Y. et al. Inhibition of Cdc42 activity extends lifespan and decreases circulating inflammatory cytokines in aged female C57BL/6 mice. Aging Cell. 2020 Sep;19(9):e13208. DOI: 10.1111/acel.13208.

9. Foulke B.A,. Kendal A.R,. Murray D.W., Pandit H. Fracture healing in the elderly: A review. Maturitas. 2016 Oct;92:49-55. DOI: 10.1016/j.maturitas.2016.07.014.

10. Liu G.X., Zhu J.C., Chen X.Y, Zhu A.Z., Liu C.C,. Lai Q., Chen S.T. Inhibition of adipogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells by erythropoietin via activating ERK and P38 MAPK. Genet Mol Res. 2015 Jun 26;14(2):6968- 77 Genet Mol Res. 2015.14:6968-6977. DOI: 10.4238/2015.June.26.5.

11. Mierke C.T, Puder S., Aermes C., Fischer T., Kunschmann T. Effect inhibition on cell mechanics depends on Rac1. Front Cell Dev Biol. 2020 Jan 28;8:13. DOI: 10.3389/fcell.2020.00013.

12. Moazzam M., Zhang M., Hussain A., Yu X., Huang J., Huang Y. The landscape of nanoparticle-based siRNA delivery and therapeutic development. Mol Ther. 2024 Feb 7;32(2):284-312. DOI: 10.1016/j.ymthe.2024.01.005.

13. Murphy N.P., Mott H.R., Owen D. Progress in the therapeutic inhibition of Cdc42 signalling. Biochem Soc Trans. 2021 Jun 30;49(3):1443-1456. DOI: 10.1042/BST20210112.

14. Nikolaou V.S,. Efstathopoulos N., Kontakis G., Kanakaris N.K., Giannoudis P.V. The influence of osteoporosis in femoral fracture healing time. Injury. 2009 Jun;40(6):663-8. DOI: 10.1016/j.injury.2008.10.035.

15. Rudiansyah M., El-Sehrawy A.A., Ahmad I., Terefe E.M., Abdelbasset W.K., Bokov D.O., Salazar A., Rizaev J.A., Muthanna F.M.S., Shalaby M.N. Osteoporosis treatment by mesenchymal stromal/stem cells and their exosomes: emphasis on signaling pathways and mechanisms. Life Sci. 2022 Oct 1;306:120717. DOI: 10.1016/j.lfs.2022.120717.

16. Rutkowski D.M., Vincenzetti V., Vavylonis D., Martin S.G. Cdc42 mobility and membrane flows regulate fission yeast cell shape and survival. 2023 Jul 21;2023.07.21.550042. DOI: 10.1101/2023.07.21.550042.

17. Safarova Y.Y., Olzhayev F., Umbayev B,. Tsoy A., Hortelano G., Tokay T. et al. Mesenchymal Stem Cells Coated with Synthetic Bone-Targeting Polymers Enhance Osteoporotic Bone Fracture Regeneration. Bioengineering (Basel). 2020 Oct 12;7(4):125. DOI: 10.3390/bioengineering7040125.

18. Umbayev B., Masoud A-R., Tsoy A., Alimbetov D., Olzhayev F., Shramko A., Kaiyrlykyzy A., Safarova Y., Davis T., Askarova S. Elevated levels of the small GTPase Cdc42 induces senescence in male rat mesenchymal stem cells. Biogeront. 2018;19:287-301. DOI: 10.1007/s10522-018-9757-5.

19. Umbayev B., Safarova Y., Yermekova A, Nessipbekova A, Syzdykova A, Askarova S. Role of a small GTPase Cdc42 in aging and age-related diseases. Biogeron. 2023;24(1):27-46. DOI: 10.1007/s10522-022-10008-9.

20. Wang Y., Yao Y. Nanofiber alignment mediates the pattern of single cell migration. Langmuir. 2020 Mar 3;36(8):2129-2135. DOI: 10.1021/acs.langmuir.9b03314.

21. Weigert M., Schmidt U. Nuclei instance segmentation and classification in histopathology images with StarDist. In: Proceedings of the IEEE International Symposium on Biomedical Imaging Challenges (ISBIC), Kolkata, India, 2022 Aug 19. DOI: 10.1109/ISBIC56247.2022.9854534.

22. Woolf A.D., Akesson K. Preventing fractures in elderly people. BMJ. 2003 Jul 12;327(7406):89-95. DOI: 10.1136/bmj.327.7406.89.

23. Xu X.P., He H.L., Hu S.L., Han J.B., Huang L.L., Xu J.Y. et al. Ang II-AT2R increases mesenchymal stem cell migration by signaling through the FAK and RhoA/Cdc42 pathways in vitro. Stem Cell Res Ther. 2017 Jul 12;8(1):164. DOI: 10.1186/s13287-017-0617-z. Retraction in: Stem Cell Res Ther. 2022 Jan 31;13(1):46. DOI: 10.1186/s13287-022-02733-2.