Иммуногистохимическая характеристика реорганизации глиальных клеток неокортекса в результате тяжелой черепно-мозговой травмы

Цель исследования – изучить реорганизацию глиоцитов и экспрессию GFAP в неокортексе крыс с помощью гистологических, иммуноморфологических и морфометрических методов (в частности фрактального анализа) после тяжелой черепно-мозговой травмы (ТЧМТ).

Материал и методы. Моделирование ТЧМТ проводили при помощи запатентованного устройства с ударным механизмом, основанного на принципе передачи кинетической энергии падающего цилиндрического груза. В ходе эксперимента крысы были разделены на 2 группы: основную (n=30) и контрольную (интактную, n=6). Головной мозг у крыс извлекали через 1, 3, 7, 14 и 30 сут после травмы. Оценку глиоцитов слоев III и V сенсомоторной коры (СМК) проводили путем анализа гистологических препаратов, окрашенных гематоксилином и  эозином,  тионином при  помощи  световой микроскопии,  иммуногистохимической реакции  на глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) и морфометрической обработки в программе Image 1.53. Фрактальный анализ астроцитарной сети осуществляли с помощью плагина FracLac 2.5. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью непараметрических методов в программе Statistica 10.0.

Результаты. На всем протяжении посттравматического периода изменения нейронов СМК сопровождались увеличением численной плотности глиоцитов. Максимальные значения содержания микроглиоцитов регистрировались уже через 1 сут после ТЧМТ. В слое III СМК их доля увеличивалась на 13,4%, а в слое V СМК – на 24,2% по сравнению с контролем. Минимальный показатель численной плотности олигодендроцитов отмечался через 30 сут после ТЧМТ: в слое III СМК его значение было на 32,2% ниже, а в слое V СМК – на 43,9% ниже, чем в контроле. Через 1 сут после травмы происходило статистически значимое увеличение численной плотности астроцитов в слоях III и V CМК выше контрольных значений. В течение 30 сут, содержание глиоцитов уменьшалось: в слое III СМК – на 23%, а в слое V СМК – на 26,8%. При экспрессии GFAP в слое III и V СМК встречались протоплазматические и волокнистые астроциты, отличающиеся размером тела и длиной отростков. Показатели, характеризующие отростки, как пространственный объект, статистически значимо изменялись в сравнении с контролем и в посттравматическом периоде между сроками. Наиболее сильно изменялась фрактальная размерность и отмечалась высокая лакунарность в слое III СМК. В течение 14 сут показатель был меньше контрольного значения, а в слое V СМК к этому сроку он восстанавливался. Наблюдаемые явления свидетельствовали о более высокой реактивной реорганизации отростков астроцитов мелкоклеточного слоя III СМК крыс.

Заключение. После ТЧМТ в СМК прослеживалась  неоднородная  реорганизация  нейроглиального  комплекса.  Обнаруженные  изменения численной плотности глиоцитов в слоях III и V СМК на протяжении всего посттравматического периода имели  гетерохронный  характер.  Данные  морфометрического  анализа  подтверждали  пространственную реорганизацию астроцитов, активную пролиферацию микроглиоцитов и олигодендроцитов – изменений, способствующих компенсаторной защите  структур  нервной  ткани  СМК  в  условиях  посттравматического периода.

1. Аврущенко М.Ш., Острова И.В. Постреанимационные изменения экспрессии мозгового нейротрофического фактора (BDNF): взаимосвязь с процессом гибели нейронов. Общая реаниматология. 2017;13(4):6–21. 2017;13(4):6-21. (In Russ.) doi: 10.15360/1813-97792017-4-6-21

2. Белошицкий В.В. Принципы моделирования черепно-мозговой травмы в эксперименте. Украинский нейрохирургический журнал. 2008;4:9–15.

3. Боровиков В. Statistica. Искусство анализа данных на компьютере. 2-ое изд. Санкт-Петербург: Питер; 2003.

4. Калинина Ю.А., Гилерович Е.Г., Коржевский Д.Э. Астроциты и их участие в механизмах терапевтического действия мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток при ишемическом повреждении головного мозга. Гены и клетки. 2019;14(1):33–40. doi 10.23868/201903004

5. Кинзерский А.А., Шоронова А.Ю., Коржук М.С., Акулинин В.А., Макарьева Л.М. Патент РФ № 2788904; 2021.

6. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Сухорукова Е.Г., Власов Т.Д. Структурная организация микроглиоцитов стриатума после транзиторной фокальной ишемии Морфология 2012;141(2):28–32.

7. Кириченко Е.Ю., Логвинов А.К., Филиппова С.Ю., Арефьев Р.А., Семынина В.Г., Лысенко Л.В. Особенности строения нейроглиососудистых ансамблей в гломерулах обонятельной луковицы крысы. Цитология. 2020;62(4):278–85. doi: 10.31857/S0041377120040057

8. Краснов А.В. Астроцитарные белки головного мозга: структура, функции, клиническое значение. Неврологический журнал. 2012;1:37–42

9. Макарьева Л.М., Акулинин В.А., Коржук М.С., Степанов С.С., Шоронова А.Ю., и др. Структурно-функциональная реорганизация сенсомоторной коры при перевязке общих сонных артерий (экспериментальное исследование). Общая реаниматология. 2022 Oct;18(5):32–43. doi: 10.15360/1813-9779-2022-5-32-43

10. Пальцын А.А., Свиридкина Н.Б. О регенерации мозга. Патогенез. 2018;16(1):83–91. doi: 10.25557/2310-0435.2018.01.83-91

11. Радьков И.В., Лаптев В.В., Плехова Н.Г. Технологии моделирования диффузной черепномозговой травмы. Современные проблемы науки и образования. 2018;4:1–9.

12. Степанов А.С., Акулинин В.А., Степанов С.С., Авдеев Д.Б. Клеточные системы восстановления и утилизации поврежденных нейронов головного мозга белых крыс после 20-минутной окклюзии общих сонных артерий. Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. 2017;103(10):1135–47.

13. Степанов С.С., Макарьева Л.М., Акулинин В.А., Коржук М.С., Шоронова А.Ю., и др. Сопоставление иммуногистохимического и ультраструктурного изучения реакции аксональных терминалей сенсомоторной коры белых крыс на перевязку общих сонных артерий. Журнал анатомии и гистопатологии. 2022;11(3):65–74. doi: 10.18499/2225-7357-2022-11-3-65-74

14. Шоронова А.Ю., Акулинин В.А., Степанов С.С., Коржук М.С., Макарьева Л.М., и др. Морфофункциональные изменения нейронов, глиальных клеток и синапсов в сенсомоторной коре после тяжелой черепно-мозговой травмы. Журнал анатомии и гистопатологии. 2023;12(1):79–87. doi: 10.18499/2225-7357-2023-12-1-79-87

15. Alwis DS, Johnstone V, Yan E, Rajan R. Diffuse traumatic brain injury and the sensory brain. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 2013 Jun 21;40(7):473–83. doi: 10.1111/1440-1681.12100

16. Arizono M, Inavalli VVGK, Panatier A, Pfeiffer T, Angibaud J, Levet F, et al. Structural basis of astrocytic Ca2+ signals at tripartite synapses. Nature Communications. 2020 Apr 20;11(1):1906. doi: 10.1038/s41467-020-15648-4

17. Azevedo FAC, Carvalho LRB, Grinberg LT, Farfel JM, Ferretti REL, Leite REP, et al. Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain. The Journal of Comparative Neurology. 2009 Apr 10;513(5):532–41. doi: 10.1002/cne.21974

18. Capizzi A, Woo J, Verduzco-Gutierrez M. Traumatic Brain Injury. Medical Clinics of North America. 2020 Mar;104(2):213–38. doi: 10.1016/j.mcna.2019.11.001

19. Cowan M, Petri WA. Microglia: Immune Regulators of Neurodevelopment. Frontiers in Immunology. 2018 Nov 7;9:2576. Doi 10.3389/fimmu.2018.02576

20. Damisah EC, Hill RA, Rai A, Chen F, Rothlin CV, Ghosh S, et al. Astrocytes and microglia play orchestrated roles and respect phagocytic territories during neuronal corpse removal in vivo. Science Advances. 2020 Jun;6(26):32–9. doi: 10.1126/sciadv.aba3239

21. Finnie J. Animal models of traumatic brain injury: a review. Australian Veterinary Journal. 2001 Sep;79(9):628–33. doi: 10.1111/j.1751-0813.2001.tb10785.x

22. Geuna S, Herrera-Rincon C. Update on stereology for light microscopy. Cell and Tissue Research. 2015 Mar 6;360(1):5–12.

23. Herculano-Houzel S. The Human Brain in numbers: a Linearly scaled-up Primate Brain. Frontiers in Human Neuroscience. 2009 Nov;3(31). doi: 10.3389/neuro.09.031.2009

24. Hilgetag CC, Barbas H. Are there ten times more glia than neurons in the brain? Brain Structure and Function. 2009 Feb 7;213(4-5):365–6. doi: 10.1007/s00429-009-0202-z

25. Eng LF, Ghirnikar RS, Lee YL. Glial Fibrillary Acidic Protein: GFAP-Thirty-One Years (1969– 2000). Neurochemical Research. 2000;25(9/10):1439–51. Doi 10.1023/a:1007677003387

26. Eyolfson E, Khan A, Mychasiuk R, Lohman AW. Microglia dynamics in adolescent traumatic brain injury. Journal of Neuroinflammation. 2020 Oct 29;17(1):318–26. doi: 10.1186/s12974-020-01994-z

27. Karperien A, Ahammer H, Jelinek HF. Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 2013;7:3–5. doi: 10.3389/fncel.2013.00003

28. Lent R, Azevedo FAC, Andrade-Moraes CH, Pinto AVO. How many neurons do you have? Some dogmas of quantitative neuroscience under revision. European Journal of Neuroscience. 2011 Dec 13;35(1):1–9. doi: 10.1111/j.1460-9568.2011.07923.x

29. Liedtke W, Edelmann W, Bieri PL, Chiu FC, Cowan NJ, Kucherlapati R, et al. GFAP Is Necessary for the Integrity of CNS White Matter Architecture and Long-Term Maintenance of Myelination. Neuron. 1996 Oct;17(4):607–15. doi: 10.1016/s0896-6273(00)80194-4

30. Mason HD, Johnson AM, Mihelson NA, Mastorakos P, McGavern DB. Glia limitans superficialis oxidation and breakdown promote cortical cell death after repetitive head injury. JCI Insight. 2021 Oct 8;6(19):1–13. doi: 10.1172/jci.insight.149229

31. Najem D, Rennie K, Ribecco-Lutkiewicz M, Ly D, Haukenfrers J, Liu Q, et al. Traumatic brain injury: classification, models, and markers. Biochemistry and Cell Biology 2018 Aug;96(4):391–406. doi: 10.1139/bcb-2016-0160

32. Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. 5-th ed. Amsterdam, Boston: Elsevier Academic Press; 2005.

33. Sestakova N, Puzserova A, Kluknavsky M, Bernatova I. Determination of motor activity and anxiety-related behaviour in rodents: methodological aspects and role of nitric oxide. Interdisciplinary Toxicology. 2013 Sep 1;6(3):126–35. doi: 10.2478/intox-2013-0020

34. Tolias CM, Bullock MR. Critical appraisal of neuroprotection trials in head injury: What have we learned? Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2004 Jan;1(1):71–9. doi: 10.1602/neurorx.1.1.71

35. Venkatesh K, Srikanth L, Vengamma B, Venkatesh K, Chandrasekhar C, Mouleshwara Prasad B, et al. In vitro differentiation of cultured human CD34+ cells into astrocytes. Neurology India 2013;61(4):383–8. doi: 10.4103/0028-3886.117615

36. Zhu H, Dahlström A. Glial fibrillary acidic protein-expressing cells in the neurogenic regions in normal and injured adult brains. Journal of Neuroscience Research. 2007;85(12):2783–92. doi: 10.1002/jnr.21257