Метод двойного иммунофлуоресцентного окрашивания для изучения кровеносных сосудов

Выявление кровеносных сосудов и оценка их функционального состояния является важной задачей современной гистологии.

Целью представленной работы стала разработка метода двойного иммунофлуоресцентного окрашивания для изучения разных типов кровеносных сосудов в легком крысы.

Материал и методы. Материалом для исследования служили образцы правого и левого легкого половозрелых (3–5 мес) крыс-самцов породы Вистар (n=5). Для выявления кровеносных сосудов использовали кроличьи поликлональные антитела к фактору Виллебранда (Agilent, США) и мышиные моноклональные (клон 1А4) антитела к гладкомышечному α-актина (Agilent, США). Анализ препаратов проводили с применением метода конфокальной лазерной микроскопии.

Результаты. В рамках представленной работы был разработан протокол двойного иммунофлуоресцентного окрашивания, позволяющий с высокой селективностью выявлять кровеносные сосуды разных типов в легком крысы. Использование в качестве одного из маркеров фактора Виллебранда позволяет легко идентифицировать эндотелий кровеносных сосудов. Добавление второго маркера – гладкомышечного α-актина  – дает возможность выявлять слой гладких моицитов, особенности строения которого позволяют определить тип кровеносного сосуда (его принадлежность к артериальному или венозному руслу). Предложенный протокол характеризуется хорошей воспроизводимостью и позволяет получать препараты высокого качества. Вследствие высокой специфической иммунореактивности используемых антител из протокола окраски может быть удален этап теплового демаскирования антигенов, что делает его менее трудоемким, сокращает время изготовления препаратов и обеспечивает лучшую сохранность срезов. Использование в качестве маркеров фактора Виллебранда и гладкомышечного α-актина делает возможным оценку не только структуры, но и функционального статуса изучаемых кровеносных сосудов, что обуславливает перспективность использования предложенного метода для научных и клиникодиагностических исследований.

1. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Сухорукова Е.Г. и др. Молекулярная морфология. Методы флуоресцентной и конфокальной лазерной микроскопии. СПб.: СпецЛит; 2014

2. Коржевский Д.Э., Кирик О.В., Сухорукова Е.Г. и др. Фактор Виллебранда эндотелиоцитов кровеносных сосудов и его использование в иммуноморфологических исследованиях. Медицинский академический журнал. 2017;17(1):34–40.

3. Чернеховская Н.Е., Андреев В.Г., Поваляев А.В., Коржева И.Ю. Легочные кровотечения. М.: МЕДпресс-информ; 2011

4. Чумасов Е.И., Петрова Е.С., Коржевский Д.Э. Структурно-функциональная характеристика эндотелиальных клеток сосудов сердца новорожденной крысы (иммуногистохимическое исследование). Регионарное кровообращение и микроциркуляция. 2018; 17(2): 80–5 doi: 10.24884/1682-6655-2018-17-2-78-83

5. Чумасов Е.И., Петрова Е.С., Коржевский Д.Э. Структурные и функциональные особенности эндотелия сосудов сердца половозрелых крыс по данным иммуногистохимического исследования. Регионарное кровообращение и микроциркуляция. 2019; 18(2): 70–7 doi: 10.24884/1682-6655-2019-18-2-70-77

6. Bacakova L, Travnickova M, Filova E, et al. The role of vascular smooth muscle cells in the physiology and pathophysiology of blood vessels. In: Sakuma K. (Ed.), Muscle Cell and Tissue. Current Status of Research Field. London, UK: IntechOpen; 2018.

7. Ervin JF, Pannell C, Szymanski M, WelshBohmer K, Schmechel DE, Hulette CM. Vascular Smooth Muscle Actin Is Reduced in Alzheimer Disease Brain: A Quantitative Analysis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 2004 Jul;63(7):735–41. doi: 10.1093/jnen/63.7.735

8. Gujam FJA, Going JJ, Edwards J, Mohammed ZMA, McMillan DC. The role of lymphatic and blood vessel invasion in predicting survival and methods of detection in patients with primary operable breast cancer. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 2014 Feb;89(2):231–41. doi: 10.1016/j.critrevonc.2013.08.014

9. Korzhevskii DE, Sukhorukova EG, Kirik OV, Grigorev IP. Immunohistochemical demonstration of specific antigens in the human brain fixed in zinc-ethanol-formaldehyde. European Journal of Histochemistry. 2015 Aug 5;59(3). doi: 10.4081/ejh.2015.2530

10. Kretschmer S, Dethlefsen I, Hagner-Benes S, Marsh LM, Garn H, König P. Visualization of Intrapulmonary Lymph Vessels in Healthy and Inflamed Murine Lung Using CD90/Thy-1 as a Marker. Fritz JH, editor. PLoS ONE. 2013 Feb 8;8(2):e55201. doi: 10.1371/journal.pone.0055201

11. McCormack JJ, Lopes da Silva M, Ferraro F, Patella F, Cutler DF. Weibel–Palade bodies at a glance. Journal of Cell Science. 2017 Nov 1;130(21):3611–7. doi: 10.1242/jcs.208033

12. Pusztaszeri MP, Seelentag W, Bosman FT. Immunohistochemical Expression of Endothelial Markers CD31, CD34, von Willebrand Factor, and Fli-1 in Normal Human Tissues. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 2006 Jan 6;54(4):385–95. doi: 10.1369/jhc.4a6514.2005

13. Rana A, Westein E, Niego B, Hagemeyer CE. Shear-Dependent Platelet Aggregation: Mechanisms and Therapeutic Opportunities. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 2019 Sep 20;6. doi: 10.3389/fcvm.2019.00141

14. Storr SJ, Safuan S, Mitra A, Elliott F, Walker C, Vasko MJ, et al. Objective assessment of blood and lymphatic vessel invasion and association with macrophage infiltration in cutaneous melanoma. Modern Pathology. 2011 Nov

15. ;25(4):493–504. doi: 10.1038/modpathol.2011.182

16. Townsley MI. Structure and Composition of Pulmonary Arteries, Capillaries, and Veins. Comprehensive Physiology. 2012 Jan; 2(1): 675–709. doi: 10.1002/cphy.c100081

17. Wang Y-D. Relationship between vascular invasion and microvessel density and micrometastasis. World Journal of Gastroenterology. 2007;13(46):6269–6273. doi: 10.3748/wjg.13.6269

18. Yang X, Sun H, Li Z, Zhang H, Yang W, Ni B, et al. Gastric cancer-associated enhancement of von Willebrand factor is regulated by vascular endothelial growth factor and related to disease severity. BMC Cancer. 2015 Feb 21;15(1). doi:

19. 1186/s12885-015-1083-6

20. Yu CH, Yhee JY, Kim JH, et al. Increased expression of vascular endothelial growth factor in neo-vascularized canine brain tissue. Can J Vet Res. 2012;76(1):62–8.