anatomyЖурнал анатомии и гистопатологииJournal of Anatomy and Histopathology2225-7357N.N. Burdenko Voronezh State Medical University10.18499/2225-7357-2025-14-1-9-20anatomy-2057Research ArticleПЕРЕДОВЫЕ СТАТЬИИммуногистохимическая верификация синапсов и применение машинного обучения для анализа синаптоархитектоники СА3 гиппокампа белых крыс в постишемическом периодеImmunohistochemical Verification of Synapses and the Use of Machine Learning for the Analysis of the Synaptoarchitecture of the CA3 Hippocampus in White Rats During the Post-Ischemic Periodhttps://orcid.org/0000-0003-0741-3337СтепановС. С.StepanovS. S.

Степанов Сергей Степанович – д-р мед. наук, старший научный сотрудник кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии.

Омск

Sergei S. Stepanov – Doct. Sci. (Med.), Senior Rresearcher of Histology, Cytology and Embryology Department of Omsk State Medical University.

Omsk

https://orcid.org/0000-0002-8392-9514СтепановА. С.StepanovA. S.

Степанов Александр Сергеевич – канд. мед. наук, зав. отделением хирургических методов лечения опухолей головы и шеи; Клинический онкологический диспансер Омской области.

Омск

Aleksandr S. Stepanov – Cand. Sci. (Med.), Head of the Department of Surgical Treatment of Head and Neck Tumors; Clinical Oncology Dispensary of Omsk Region.

Omsk

ctepan55@yandex.ruhttps://orcid.org/0000-0003-3667-7905ЦускманИ. Г.TsuskmanI. G.

Цускман Ирина Геннадиевна – канд. ветеринар. наук, доцент кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии.

Омск

Irina G. Tsuskman – Cand. Sci. (Vet.), associate professor of the Department of histology, cytology and embryology of Omsk State Medical University.

Omsk

ira.tsuskman@mail.ruhttps://orcid.org/0000-0001-6097-7970АкулининВ. A.AkulininV. A.

Акулинин Виктор Александрович – д-р. мед. наук, профессор, зав. кафедрой гистологии, цитологии и эмбриологии.

ул. Ленина, 12, Омск, 644099

Viktor A. Akulinin – Doct. Sci. (Med.), Professor, Head of Histology, Cytology and Embryology Department of Omsk State Medical University.

Omsk

v_akulinin@outlook.comОмский государственный медицинский университетOmsk State Medical University202506042025141920Copyright © Степанов С.С., Степанов А.С., Цускман И.Г., Акулинин В.A., 20252025Степанов С.С., Степанов А.С., Цускман И.Г., Акулинин В.A.Stepanov S.S., Stepanov A.S., Tsuskman I.G., Akulinin V.A.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://anatomy.elpub.ru/jour/article/view/2057

Рассмотрены методические аспекты применения алгоритмов машинного обучения для поиска новых возможностей в интерпретации межнейронных связей. Цель исследования – показать, что комбинация Ilastik и StarDist эффективна для морфометрической характеристики гигантских синаптических терминалей в stratum lucidum СА3 гиппокампа белых крыс в норме и в постишемическом периоде. Материал и методы. Ишемию головного мозга у белых крыс Wistar моделировали двусторонней окклюзией общих сонных артерий (ООСА) на 20 мин. Исследовались животные без воздействия (n=6, контроль) и через 6 ч, 1, 3, 7, 14 и 30 сут после ООСА (n=36). Использовали окраски гематоксилином и эозином, тионином по Нисслю, иммуногистохимическую реакцию на синаптофизин. Определяли численную плотность (ЧПТ), размеры, интенсивность окраски и площадь терминалей, применяли плагины Ilastik и StarDist на платформе ImageJ/Fiji. Статистический анализ проводили непараметрическими методами в программе Statistica 8.0. Результаты. Относительная площадь терминалей при ручном методе и машинном обучении не различалась. Машинное обучение предоставило дополнительную информацию о численной плотности, размерах и средней яркости терминалей. Через 6 ч после ООСА ЧПТ уменьшилась на 44,3%, но затем восстанавливалась в течение 7 сут. Средняя площадь терминалей была больше на 16,7% через 6 ч и 1 сут, а через 14 сут – меньше контрольного уровня. Яркость пикселей терминалей была обратно пропорциональна содержанию в них хромогена: увеличивалась через 6 ч и 1 сут после ООСА, затем восстанавливалась до уровня контроля. Корреляционные связи наблюдались между площадью и яркостью терминалей (R=0,78). Заключение. Использование комбинации Ilastik и StarDist позволило точно оценить численную плотности, размеры, форму, относительную площадь и интенсивность окраски синаптических терминалей в гиппокампе. В сравнении с ручным методом, применение машинного обучения обеспечило значительно больше информации о терминалях на цветных иммуногистохимических изображениях.

This study examines the methodological aspects of applying machine learning algorithms to explore new opportunities in interpreting inter-neuronal connections. The aim was to demonstrate that the combination of Ilastik and StarDist is effective for the morphometric characterization of giant synaptic terminals in the stratum lucidum of CA3 in the hippocampus of white rats under normal conditions and in the post-ischemic period. Material and methods. Cerebral ischemia in Wistar white rats was modeled by bilateral occlusion of the common carotid arteries (OCCA) for 20 minutes. Animals were studied without intervention (n=6, control) and at 6 hours, 1, 3, 7, 14, and 30 days after OCCA (n=36). Staining with hematoxylin and eosin, Nissl staining with thionine, as well as immunohistochemical reaction for synaptophysin, were used. Numerical density (NDT), sizes, staining intensity, and area of the terminals were determined, and the Ilastik and StarDist plugins were applied on the ImageJ/Fiji platform. Statistical analysis was performed using non-parametric methods in Statistica 8.0. Results. The relative area of the terminals did not differ between the manual method and machine learning. Machine learning provided additional information on numerical density, sizes, and average brightness of the terminals. At 6 hours after OCCA, NDT decreased by 44.3%, but then recovered over 7 days. The average area of the terminals was 16.7% larger at 6 hours and 1 day, but smaller than the control level at 14 days. The brightness of the terminal pixels was inversely proportional to the content of chromogen: it increased at 6 hours and 1 day after OCCA, then returned to control levels. Correlations were observed between the area and brightness of the terminals (R=0.78). Conclusion. The use of the combination of Ilastik and StarDist allowed for accurate assessment of numerical density, sizes, shape, relative area, and staining intensity of synaptic terminals in the hippocampus. Compared to the manual method, the application of machine learning provided significantly more information about the terminals in color immunohistochemical images.

ишемия головного мозгасинапсыгиппокампиммуногистохимияморфометриямашинное обучениеbrain ischemiasynapseshippocampusimmunohistochemistrymorphometrymachine learningReferencesАвдеев Д.Б., Акулинин В.А., Степанов А.С., Горбунова А.В., Степанов С.С. Плейотропные ферменты апоптоза и синаптическая пластичность гиппокампа белых крыс после окклюзии общих сонных артерий. Сибирский медицинский журнал. 2018;33(3):102–110. doi: 10.29001/2073-8552-2018-33-3-102-110.Avdeev DB, Akulinin VA, Stepanov AS, Gorbunova AV, Stepanov SS. Plejotropnye fermenty apoptoza i sinapticheskaya plastichnost' gippokampa belyh krys posle okklyuzii obshchih sonnyh arterij. Sibirskij medicinskij zhurnal. 2018;33(3):102–110. (In Russ.). doi: 10.29001/2073-8552-2018-33-3-102-110.Боровиков В. Statistica. Искусство анализа данных на компьютере. 2-ое изд. СПб: Питер; 2003. 688.Borovikov V. Statistica. Iskusstvo analiza dannyh na komp'yutere. 2-oe izd. SPb: Piter; 2003: 688. (In Russ.).Семченко В.В., Степанов С.С, Ерениев С.И. Синаптическая пластичность головного мозга (фундаментальные и прикладные аспекты). М: Директ-Медиа; 2024. 416.Semchenko VV, Stepanov SS, Ereniev SI. Sinapticheskaya plastichnost' golovnogo mozga (fundamental'nye i prikladnye aspekty). M: Direkt-Media; 2024. 416. (In Russ.).Степанов С.С., Кошман И.П., Шоронова А.Ю., Калиничев А.Г., Акулинин В.А., Степанов А.С., Авдеев Д.Б., Маркелова М.В. Структурные основы изменения межнейронной коммуникации нейронов поля СА3 гиппокампа белых крыс после тяжелой черепно-мозговой травмы. Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 2021;65(1):22–34. doi: 10.25557/0031-2991.2021.01.22-34.Stepanov SS, Koshman IP, Shoronova AYU, Kalinichev AG, Akulinin VA, Stepanov AS, Avdeev DB, Markelova MV. Strukturnye osnovy izmeneniya mezhnejronnoj kommunikacii nejronov polya CA3 gippokampa belyh krys posle tyazheloj cherepno-mozgovoj travmy. Patologicheskaya fiziologiya i eksperimental'naya terapiya. 2021;65(1):22–34. (In Russ.). doi: 10.25557/0031-2991.2021.01.22-34.Степанов А.С., Акулинин В.А., Степанов С.С., Авдеев Д.Б., Горбунова А.В. Коммуникация нейронов поля CA3 гиппокампа головного мозга белых крыс после острой ишемии. Общая реаниматология. 2018;12(5):38–49. doi: 10.15360/1813-9779-2018-5-38-49.Stepanov AS, Akulinin VA, Stepanov SS, Avdeev DB, Gorbunova AV. Kommunikaciya nejronov polya CA3 gippokampa golovnogo mozga belyh krys posle ostroj ishemii. Obshchaya reanimatologiya. 2018;12(5):38–49. (In Russ.). doi: 10.15360/1813-9779-2018-5-38-49.Степанов С.С., Макарьева Л.М., Акулинин В.А., Коржук М.С., Шоронова А.Ю., Авдеев Д.Б., Цускман И.Г., Слободская А.В. Сопоставление иммуногистохимического и ультраструктурного изучения реакции аксональных терминалей сенсомоторной коры белых крыс на перевязку общих сонных артерий. Журнал анатомии и гистопатологии. 2022;11(3): 65–74. doi: 10.18499/2225-7357-2022-11-3-65-74.Stepanov SS, Makar'eva LM, Akulinin VA, Korzhuk MS, SHoronova AYU, Avdeev DB, Cuskman IG, Slobodskaya AV. Sopostavlenie immunogistohimicheskogo i ul'trastrukturnogo izucheniya reakcii aksonal'nyh terminalej sensomotornoj kory belyh krys na perevyazku obshchih sonnyh arterij. ZHurnal anatomii i gistopatologii. 2022;11(3):65–74. (In Russ.). doi: 10.18499/2225-7357-2022-11-3-65-74.Berg S, Kutra D, Kroeger T, Straehle Ch. et al. Ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 2019;16(12):1226–1232. doi: 10.1038/s41592-019-0582-9.Berg S, Kutra D, Kroeger T, Straehle Ch. et al. Ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 2019;16(12):1226–1232. doi: 10.1038/s41592-019-0582-9.Calhoun ME, Jucker M, Martin LJ, Thinakaran G, Price DL, Mouton PR. Comparative evaluation of synaptophysin-based methods for quantification of synapses. J Neurocytol. 1996;25(1):821–828. doi: 10.1007/BF02284844.Calhoun ME, Jucker M, Martin LJ, Thinakaran G, Price DL, Mouton PR. Comparative evaluation of synaptophysin-based methods for quantification of synapses. J Neurocytol. 1996;25(1):821–828. doi: 10.1007/BF02284844.Ciresan Dan, Meier U, Schmidhuber J. Multicolumn deep neural networks for image classification. 2012 IEEE Conference on Computer Vision and Pattern Recognition: journal. 2012:3642–3649. doi: 10.1109/cvpr.2012.6248110.Ciresan Dan, Meier U, Schmidhuber J. Multicolumn deep neural networks for image classification. 2012 IEEE Conference on Computer Vision and Pattern Recognition: journal. 2012:3642–3649. doi: 10.1109/cvpr.2012.6248110.Cortada M, Sauteur L, Lanz M, Levano S, Bodmer D. A deep learning approach to quantify auditory hair cells. Hear Res. 2021;15(409):108317. doi: 10.1016/j.heares.2021.108317.Cortada M, Sauteur L, Lanz M, Levano S, Bodmer D. A deep learning approach to quantify auditory hair cells. Hear Res. 2021;15(409):108317. doi: 10.1016/j.heares.2021.108317.Dailey ME, Buchanan J, Bergles DE, Smith SJ. Mossy fiber growth and synaptogenesis in rat hippocampal slices in vitro. J Neurosci. 1994;14(3Pt1):1060–1078. doi: 10.1523/JNEUROSCI.14-03-01060.Dailey ME, Buchanan J, Bergles DE, Smith SJ. Mossy fiber growth and synaptogenesis in rat hippocampal slices in vitro. J Neurosci. 1994;14(3Pt1):1060–1078. doi: 10.1523/JNEUROSCI.14-03-01060.Fazeli E, Roy NH, Follain G, Laine RF, von Chamier L, Hänninen PE, Eriksson JE, Tinevez JY, Jacquemet G. Automated cell tracking using StarDist and TrackMate. F1000Res. 2020;28(9):1279. doi: 10.12688/f1000research.27019.1.Fazeli E, Roy NH, Follain G, Laine RF, von Chamier L, Hänninen PE, Eriksson JE, Tinevez JY, Jacquemet G. Automated cell tracking using StarDist and TrackMate. F1000Res. 2020;28(9):1279. doi: 10.12688/f1000research.27019.1.Grys BT, Lo DS, Sahin N, Kraus OZ, Morris Q, Boone C, Andrews BJ. Machine learning and computer vision approaches for phenotypic profiling. J Cell Biol. 2017;2(216(1)):65–71. doi: 10.1083/jcb.201610026.Grys BT, Lo DS, Sahin N, Kraus OZ, Morris Q, Boone C, Andrews BJ. Machine learning and computer vision approaches for phenotypic profiling. J Cell Biol. 2017;2(216(1)):65–71. doi: 10.1083/jcb.201610026.Herbert AD, Carr AM, Hoffmann E. FindFoci: A Focus Detection Algorithm with Automated Parameter Training That Closely Matches Human Assignments, Reduces Human Inconsistencies and Increases Speed of Analysis. PLoS ONE. 2014;9(12):e114749. doi: 10.1371/journal.pone.0114749.Herbert AD, Carr AM, Hoffmann E. FindFoci: A Focus Detection Algorithm with Automated Parameter Training That Closely Matches Human Assignments, Reduces Human Inconsistencies and Increases Speed of Analysis. PLoS ONE. 2014;9(12):e114749. doi: 10.1371/journal.pone.0114749.Ippolito DM, Eroglu C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. J Visual Experiments. 2010;16(45):2270. doi: 10.3791/2270.Ippolito DM, Eroglu C. Quantifying Synapses: an Immunocytochemistry-based Assay to Quantify Synapse Number. J Visual Experiments. 2010;16(45):2270. doi: 10.3791/2270.Kreshuk A, Zhang C. Machine Learning: Advanced Image Segmentation Using ilastik. Methods Mol Biol. 2019;2040:449–463. doi: 10.1007/978-1-4939-9686-5_21.Kreshuk A, Zhang C. Machine Learning: Advanced Image Segmentation Using ilastik. Methods Mol Biol. 2019;2040:449–463. doi: 10.1007/978-1-4939-9686-5_21.Kreshuk A, Straehle CN, Sommer C, Koethe U. et al. Automated Detection and Segmentation of Synaptic Contacts in Nearly Isotropic Serial Electron Microscopy Images. PLOS ONE. 2011;6(10):e24899. doi: 10.1371/journal.pone.0024899.Kreshuk A, Straehle CN, Sommer C, Koethe U. et al. Automated Detection and Segmentation of Synaptic Contacts in Nearly Isotropic Serial Electron Microscopy Images. PLOS ONE. 2011;6(10):e24899. doi: 10.1371/journal.pone.0024899.Kurnia KA, Sampurna BP, Audira G, Juniardi S, Vasquez RD, Roldan MJM, Tsao CC, Hsiao CD. Performance Comparison of Five Methods for Tetrahymena Number Counting on the ImageJ Platform: Assessing the Built-in Tool and Machine-Learning-Based Extension. Int J Mol Sci. 2022;26(23(11)):6009. doi: 10.3390/ijms23116009.Kurnia KA, Sampurna BP, Audira G, Juniardi S, Vasquez RD, Roldan MJM, Tsao CC, Hsiao CD. Performance Comparison of Five Methods for Tetrahymena Number Counting on the ImageJ Platform: Assessing the Built-in Tool and Machine-Learning-Based Extension. Int J Mol Sci. 2022;26(23(11)):6009. doi: 10.3390/ijms23116009.Kurnia KA, Lin YT, Farhan A, Malhotra N, Luong CT, Hung CH, Roldan MJM, Tsao CC, Cheng TS, Hsiao CD. Deep Learning-Based Automatic Duckweed Counting Using StarDist and Its Application on Measuring Growth Inhibition Potential of Rare Earth Elements as Contaminants of Emerging Concerns. Toxics. 2023;8(11(8)):680. doi: 10.3390/toxics11080680.Kurnia KA, Lin YT, Farhan A, Malhotra N, Luong CT, Hung CH, Roldan MJM, Tsao CC, Cheng TS, Hsiao CD. Deep Learning-Based Automatic Duckweed Counting Using StarDist and Its Application on Measuring Growth Inhibition Potential of Rare Earth Elements as Contaminants of Emerging Concerns. Toxics. 2023;8(11(8)):680. doi: 10.3390/toxics11080680.Laux L, Cutiongco MFA, Gadegaard N, Jensen BS. Interactive machine learning for fast and robust cell profiling. PLoS One. 2020;11(15(9)):e0237972. DOI: 10.1371/journal.pone.0237972Laux L, Cutiongco MFA, Gadegaard N, Jensen BS. Interactive machine learning for fast and robust cell profiling. PLoS One. 2020;11(15(9)):e0237972. DOI: 10.1371/journal.pone.0237972Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. 5-th ed. Amsterdam, Boston: Elsevier Academic Press, 2005.Paxinos G, Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates. 5-th ed. Amsterdam, Boston: Elsevier Academic Press, 2005.Pelkey KA, McBain CJ. Target-cell-dependent plasticity within the mossy fibre-CA3 circuit reveals compartmentalized regulation of presynaptic function at divergent release sites. J Physiol. 2008;586(6):1495–1502. doi: 10.1113/jphysiol.2007.148635.Pelkey KA, McBain CJ. Target-cell-dependent plasticity within the mossy fibre-CA3 circuit reveals compartmentalized regulation of presynaptic function at divergent release sites. J Physiol. 2008;586(6):1495–1502. doi: 10.1113/jphysiol.2007.148635.Sommer C, Straehle C, Koethe U, Hamprecht FA. "Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit". 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. 2011:230–233. doi: 10.1109/ISBI.2011.5872394.Sommer C, Straehle C, Koethe U, Hamprecht FA. "Ilastik: Interactive learning and segmentation toolkit". 2011 IEEE International Symposium on Biomedical Imaging: From Nano to Macro. 2011:230–233. doi: 10.1109/ISBI.2011.5872394.Tinevez JY, Perry N, Schindelin J, Hoopes GM, Reynolds GD, Laplantine E, Bednarek SY, Shorte SL, Eliceiri KW. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 2017 Feb 15;115:80-90. doi: 10.1016/j.ymeth.2016.09.016.Tinevez JY, Perry N, Schindelin J, Hoopes GM, Reynolds GD, Laplantine E, Bednarek SY, Shorte SL, Eliceiri KW. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 2017 Feb 15;115:80-90. doi: 10.1016/j.ymeth.2016.09.016.Urru A, González Ballester MA, Zhang C. 2D + Time Object Tracking Using Fiji and ilastik. Methods Mol Biol. 2019;2040:423–448. doi: 10.1007/978-1-4939-9686-5_20.Urru A, González Ballester MA, Zhang C. 2D + Time Object Tracking Using Fiji and ilastik. Methods Mol Biol. 2019;2040:423–448. doi: 10.1007/978-1-4939-9686-5_20.Weigert M, Schmidt U. Nuclei instance segmentation and classification in histopathology images with StarDist. In: Proceedings of the IEEE International Symposium on Biomedical Imaging Challenges (ISBIC), Kolkata, India, 2022. doi: 10.1109/ISBIC56247.2022.9854534.Weigert M, Schmidt U. Nuclei instance segmentation and classification in histopathology images with StarDist. In: Proceedings of the IEEE International Symposium on Biomedical Imaging Challenges (ISBIC), Kolkata, India, 2022. doi: 10.1109/ISBIC56247.2022.9854534.Zhu J, Zou H, Rosset S, Hastie T. Multi-class AdaBoost. Statistics and Its Interface. 2009;2: 349–360. doi: 10.4310/Sll.2009.v2.n3.a8Zhu J, Zou H, Rosset S, Hastie T. Multi-class AdaBoost. Statistics and Its Interface. 2009;2: 349–360. doi: 10.4310/Sll.2009.v2.n3.a8

The authors declare that there are no conflicts of interest present.