anatomyЖурнал анатомии и гистопатологииJournal of Anatomy and Histopathology2225-7357N.N. Burdenko Voronezh State Medical University10.18499/2225-7357-2019-8-4-53-59anatomy-1002Research ArticleОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯМолекулярно-генетические аспекты оптимизирующего влияния окситоцина на репаративные процессы эпителиальных и стромальных структур роговицы глаза кроликовMolecular Genetic Aspects of the Optimizing Effect of Oxytocin on the Reparative Processes of Rabbit Eye Corneal Epithelial and Stromal StructuresЧупровА. Д.ChuprovA. D.

Чупров Александр Дмитриевич.

ул. Салмышская, 17, Орунбург, 460047.

Aleksandr Chuprov.

ul. Salmyshskaya, 17, Orenburg, 460047.

wedil@mail.ruСтадниковА. А.StadnikovA. A.

Orenburg.

ОлейникД. В.OleinikD. V.

ул. Салмышская, 17, Орунбург, 460047.

ul. Salmyshskaya, 17, Orenburg, 460047.

ГоголеваН. Е.GogolevaN. E.

Казань.

ПлотниковА. О.PlotnikovA. O.

Оренбург.

МиронычеваА. А.MironychevaA. A.

Казань.

ЧеркасовС. В.CherkasovS. V.

Оренбург.

Оренбургский филиал ФГАУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава РоссииOrenburg Branch S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State InstitutionОренбургский государственный медицинский университет Минздрава РоссииOrenburg State Medical UniversityКазанский институт биохимии и биофизики ФИЦ «Казанский научный центр Российской академии наук»Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics of Kazan Science Centre of the Russian Academy of SciencesИнститут клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наукInstitute for Cellular and Intracellular Symbiosis Ural Branch of the Russian Academy of Sciences201924122019845359Copyright © Чупров А.Д., Стадников А.А., Олейник Д.В., Гоголева Н.Е., Плотников А.О., Миронычева А.А., Черкасов С.В., 20192019Чупров А.Д., Стадников А.А., Олейник Д.В., Гоголева Н.Е., Плотников А.О., Миронычева А.А., Черкасов С.В.Chuprov A.D., Stadnikov A.A., Oleinik D.V., Gogoleva N.E., Plotnikov A.O., Mironycheva A.A., Cherkasov S.V.Данная работа распространяется под лицензией Creative Commons Attribution 4.0.This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 License.https://anatomy.elpub.ru/jour/article/view/1002

Цель – определить регенераторное влияние окситоцина на экспрессию генов PAX6, MKI67, TAB3, соответственно, при экспериментальной эрозии роговицы.

Материал  и методы

Материал  и методы. Сформировано  3 группы  экспериментальных  животных  (n=6). 1-й и 2-й группе выполнена эрозия роговицы диаметром 8 мм. 3-я группа контрольная – без повреждения роговицы. 1-й группе (n=2) инстиллировали в конъюнктивальный мешок антибиотик ципромед 0.3%; 2-й группе (n=2) – окситоцин 5 МЕ и ципромед 0.3%. У всех животных забирали образцы переднего эпителия и стромы на 4-е и 8-е сутки эксперимента, изготавливали гистологические препараты. Из образцов выделяли мРНК, относительное содержание которой оценивали методом электрофореза. Обратной транскрипцией получали кДНК. По результатам real-time PCR оценивали экспрессию изучаемых генов.

Результаты

Результаты. Экспрессию целевых генов PAX6, MKI67, TAB3 нормализовали относительно генов «домашнего хозяйства» HPRT и RPL5 в программе REST. Окситоцин стимулировал усиление экспрессии гена MKI67 в строме (в 2.3 раза на 4-е сутки) с последующей нормализацией на 8-е сутки. Гены PAX6 и TAB3, напротив, снижали свою экспрессию под действием окситоцина. В эпителии на 8-е сутки под действием окситоцина возрастала экспрессия гена PAX6 (в 2.1 раза), при этом экспрессия генов MKI67 и TAB3 по сравнению с контролем практически не изменялась (0.72 и 1.1 раз, соответственно).

Заключение

Заключение. Установлен  новый механизм воздействия  окситоцина  на процесс восстановления роговицы  при  ее  повреждении,  заключающийся  в  дифференциальной  стимуляции  экспрессии  генов MKI67 и PAX6, участвующих в регенерации стромы и эпителия роговицы, соответственно.

The aim of study was to determine the regenerative effect of oxytocin on the expression of PAX6, MKI67, TAB3 genes, respectively, during experimental corneal erosion.

Material and methods

Material and methods. The study involved experimental animals divided into three groups (6 rabbits total). Groups 1 and 2 were simulated erosion of the cornea 8mm in diameter. Animals of group 3 – control – were without damage to the cornea. Group 1 consisting of 2 rabbits was instilled antibiotic cypromed 0.3% in the conjunctival sac; group 2 consisting of 2 rabbits was instilled oxytocin 5ME and cypromed 0.3%. Samples of the anterior epithelium and stroma were taken in all animals on the 4th and 8th day of the experiment, histological preparations were made. mRNA, the relative content of which was evaluated by electrophoresis, was isolated from the samples. cDNA was obtained using reverse transcription. The expression of the studied genes was evaluated based on the real-time PCR.

Results

Results. The expression of the target genes PAX6, MKI67, TAB3 was normalized relative to the “house-hold” genes HPRT and RPL5 using REST program. Oxytocin stimulated increased expression of the MKI67 gene in the stroma (2.3 times on the 4th day), followed by normalization on the 8th day. PAX6 and TAB3 genes, in contrast, decreased their expression under the effect of oxytocin. PAX6 gene expression increased in the epithelium under the effect of oxytocin (2.1 times) on the 8th day, while MKI67 and TAB3 genes expression remained virtually unchanged compared to the control (0.72 and 1.1 times, respectively).

Conclusion

Conclusion. The authors have elucidated a new mechanism of action of oxytocin on the corneal restoration process during the damage of cornea. This mechanism represents differential stimulation of expression of MKI67 and PAX6 genes involved in the regeneration of stroma and corneal epithelium, respectively.

регенерацияроговицаэкспрессия геновокситоцинregenerationcorneagene expressionoxytocinReferencesБабиченко И.И., Ковязин В.А. Новые методы иммуногистохимической диагностики опухолевого роста. М.: Изд-во РУДН; 2008. 109Babichenko II, Kovyazin VA. New methods of immunohistochemical diagnosis of tumor growth. Moscow: RUDN; 2008. 109 (in Russian).Бухарин О.В. Гормоны задней доли гипофиза окситоцин и вазопрессин как медиаторы иммуногенеза. В кн: Морфогенез и регенерация покровных и железистых эпителиев в онтогенезе и в условиях эксперимента. Оренбург. 1981: 59–64Bukharin OV. Posterior pituitary hormones oxytocin and vasopressin as mediators of immunogenesis. In: Morphogenesis and regeneration of integumentary and glandular epithelium in ontogenesis and experimental conditions. Orenburg. 1981: 59–64 (in Russian).Гавриленко В.Г., Есипов В.К., Сивожелезов К.Г. Морфологическая характеристика раневого процесса у больных с диабетическими гнойно-некротическими поражениями стоп при воздействии окситоцином. Морфология. 2003; 5: 24–28Gavrilenko VG, Esipov VK, Sivozhelezov KG. Morphological characteristic of wound healing process in patients with diabetic purulentnecrotic foot lesion treated with oxytocin. Morfologiia. 2003; 5: 24–28 (in Russian).Гололобов В.Г., Гайворонский И.В., Деев Р.В., Рудько А.С., Эллиниди В.Н., Аникеева Н.В., Сухинин М.В. Репаративная регенерация многослойного эпителия роговицы: биотехнологический потенциал. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2008; 4(3):55–9Gololobov G, Gayvoronsky IV, Deev RV, Rud'koAS, Ellinidi VN, Anikeeva NV, Sukhinin MV. Regenerative regeneration multiiayered corneal epithelium: biotechnological potential. Genes and Cells. 2008; 4(3):55–9 (in Russian).Горбунов А.А., Канюков В.Н., Стадников А.А. Реактивность и пластичность тканей конъюнктивы в условиях ее механической травматизации и экзогенного введения окситоцина: материалы VII всероссийской конференции «Нейроэндокринология-2005». С.-Петербург; 2005:166–7Gorbunov AA, Kanyukov VN, Stadnikov AA. Reactivity and plasticity of conjunctival tissues under conditions of its mechanical traumatization and exogenous oxytocin administration: proceedings of the VII all-Russian conference "Neuroendocrinology- 2005". Saint-Petersburg; 2005:166–7 (in Russian).Курлаев П.П., Зак В.И. Применение окситоцина в комбинации с антибиотиками при лечении больных с лактационным маститом. Хирургия. Журнал им. Н.И. Пирогова. 1988; 4:58–61Kurlaev PP, Zak VI. Use of oxytocin in combination with antibiotics in the treatment of patients with stagnation mastitis. Khirurgiya. Zhurnal imeni N.I. Pirogova. 1988; 4:58–61] (in Russian).Скоробогатых Ю.И., Перунова Н.Б., Курлаев П.П., Бухарин О.В. Экспериментальное изучение комбинации ципрофлоксацина с окситоцином на образование биопленок условно патогенными бактериями. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2010; 6:3–7Skorobogatykh YuI, Perunova NB, Kurlaev PP, Bukharin OV. Eksperimental'noe izuchenie kombinatsii tsiprofloksatsina s oksitotsinom na obrazovanie bioplenok uslovno patogennymi bakteriyami. Journal of microbiology epidemiology immunobiology. 2010; 6:3–7 (in Russian).Стадников А.А., Бухарин О.В. Гипоталамическая нейросекреция и структурно-функциональный гомеостаз про- и эукариот (морфологические основы реактивности, пластичности и регенерации). Оренбург: ОрГМА; 2012. 207Stadnikov AA, Bukharin OV. Hypothalamic neurosecretion and structural-functional homeostasis of Pro-and eukaryotes (morphological bases of reactivity, plasticity and regeneration). Orenburg: OrSMA; 2012. 207 (in Russian).Стадников Б.А., Шеина Е.А. Влияние гипоталамических нонапептидов на регенерацию панкреатоцитов при остром экспериментальном панкреатите. Актуальные вопросы военной и практической медицины: сборник трудов. Оренбург; 2002. 168–69Stadnikov BA, Sheina EA. Vliyanie gipotalamicheskikh nonapeptidov na regeneratsiyu pankreatotsitov pri ostrom eksperimental'nom pankreatite: Topical issues of military and practical medicine. Orenburg; 2002. 168–69 (in Russian).Close JL, Gumuscu В, Reh T. Retinal neurons regulate proliferation of postnatal progenitors and Muller glia in the rat retina via TGF signaling. Development. 2005 Jul 1;132(13):3015–26. doi: 10.1242/dev.01882Close JL, Gumuscu В, Reh T. Retinal neurons regulate proliferation of postnatal progenitors and Muller glia in the rat retina via TGF signaling. Development. 2005 Jul 1;132(13):3015–26. doi: 10.1242/dev.01882Cvekl A, Piatigorsky J. Lens development and crystallin gene expression: many roles for Pax-6. BioEssays. 1996 Aug;18(8):621–30. doi: 10.1002/bies.950180805Cvekl A, Piatigorsky J. Lens development and crystallin gene expression: many roles for Pax-6. BioEssays. 1996 Aug;18(8):621–30. doi: 10.1002/bies.950180805Du Y, Funderburgh ML, Mann MM, SundarRaj N, Funderburgh JL. Multipotent Stem Cells in Human Corneal Stroma. Stem Cells. 2005 Oct;23(9):1266–75. doi: 10.1634/stemcells.2004-0256Du Y, Funderburgh ML, Mann MM, SundarRaj N, Funderburgh JL. Multipotent Stem Cells in Human Corneal Stroma. Stem Cells. 2005 Oct;23(9):1266–75. doi: 10.1634/stemcells.2004-0256Hanna C, Bicknell DS, O'Brien JE. Cellturnover in the adult human eye. Arch Ophthalmol. 1961; 65:695–703.Hanna C, Bicknell DS, O'Brien JE. Cellturnover in the adult human eye. Arch Ophthalmol. 1961; 65:695–703.Hsieh Y-W, Zhang X-M, Lin E, Oliver G, Yang X-J. The Homeobox Gene Six3 Is a Potential Regulator of Anterior Segment Formation in the Chick Eye. Developmental Biology. 2002 Aug;248(2):265–80. doi: 10.1006/dbio.2002.0732Hsieh Y-W, Zhang X-M, Lin E, Oliver G, Yang X-J. The Homeobox Gene Six3 Is a Potential Regulator of Anterior Segment Formation in the Chick Eye. Developmental Biology. 2002 Aug;248(2):265–80. doi: 10.1006/dbio.2002.0732García-Villegas R, Escamilla J, Sánchez-Guzmán E, Pastén A, Hernández-Quintero M, Gómez-Flores E, et al. Pax-6 is expressed early in the differentiation of a corneal epithelial model system. Journal of Cellular Physiology. 2009 Aug;220(2):348–56. doi: 10.1002/jcp.21771García-Villegas R, Escamilla J, Sánchez-Guzmán E, Pastén A, Hernández-Quintero M, Gómez-Flores E, et al. Pax-6 is expressed early in the differentiation of a corneal epithelial model system. Journal of Cellular Physiology. 2009 Aug;220(2):348–56. doi: 10.1002/jcp.21771Maeng Y-S, Lee G-H, Lee B, Choi S-I, Kim T, Kim EK. Role of TGFBIp in Wound Healing and Mucin Expression in Corneal Epithelial Cells. Yonsei Medical Journal. 2017;58(2):423–31. doi: 10.3349/ymj.2017.58.2.423Maeng Y-S, Lee G-H, Lee B, Choi S-I, Kim T, Kim EK. Role of TGFBIp in Wound Healing and Mucin Expression in Corneal Epithelial Cells. Yonsei Medical Journal. 2017;58(2):423–31. doi: 10.3349/ymj.2017.58.2.423Pfaffl MW, Horgan GW, Dempfle L. Relative Expression Software Tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in Real-Time PCR. Nucleic Acids Research. 2002; 30(9):36. doi: 10.1093/nar/30.9.e36Pfaffl MW, Horgan GW, Dempfle L. Relative Expression Software Tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in Real-Time PCR. Nucleic Acids Research. 2002; 30(9):36. doi: 10.1093/nar/30.9.e36Polisetty N, Fatima A, Madhira SL, Sangwan VS, Vemuganti GK. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Molecular Vision. 2008 Mar 4;14:431–42.Polisetty N, Fatima A, Madhira SL, Sangwan VS, Vemuganti GK. Mesenchymal cells from limbal stroma of human eye. Molecular Vision. 2008 Mar 4;14:431–42.Ren S, Zhang F, Li C, Jia C, Li S, Xi H, Zhang H, Yang L, Wang Y. Selection of housekeeping genes for use in quantitative reverse transcription PCR assays on the murine cornea. Molecular Vision. 2010 Jun 11;16:1076–86.Ren S, Zhang F, Li C, Jia C, Li S, Xi H, Zhang H, Yang L, Wang Y. Selection of housekeeping genes for use in quantitative reverse transcription PCR assays on the murine cornea. Molecular Vision. 2010 Jun 11;16:1076–86.Zhao S, Chen Q, Hung F, Overbeek P. BMP signaling is required for development of the ciliary body. Development. 2002 Oct;129(19):4435–42.Zhao S, Chen Q, Hung F, Overbeek P. BMP signaling is required for development of the ciliary body. Development. 2002 Oct;129(19):4435–42.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.